Identification des gènes essentiels in vitro de Pseudomonas aeruginosa OprD mutant résistant aux carbapénèmes
Abstract
Introduction Pseudomonas aeruginosa (PA) OprD mutant est une
souche résistante aux carbapénèmes par perte fonctionnelle la
porine OprD. Elle présente une pathogénicité augmentée vis-à-vis
de l’épithélium des voies aériennes en contrebalanc¸ant la réponse
oxydative antibactérienne. Pour tenter d’appréhender ce phénomène, nous avons cherché à déterminer les gènes essentiels de
PA14 OprD mutant par TnSeq (Transposon Sequencing).
Méthodes La construction de la banque de mutant PA14oprD a
été réalisée par intégration d’un transposon au niveau des sites
thymine-adénine (TA) du génome de fac¸on aléatoire et unique
et inactivant ainsi dans chaque bactérie constituant la banque,
un gène de l’ensemble du chromosome. Les banques PA14 WT et
PA14oprD ont ensuite été cultivées en milieu LB et l’ADN génomique bactérien a été extrait, purifié, digéré par l’enzyme de
restriction MmeI, ligaturé à des adaptateurs, amplifié par PCR
puis séquencé à haut débit en « single-read » sur Nextseq 500.
L’analyse des données de TnSeq n’étant pas standardisée, différentes Méthodes et paramètres d’analyses ont été comparés
pour déterminer les gènes essentiels avec les logiciels TRANSIT et
FiTnEss. Les gènes identifiés ont ensuite été annotés avec leurs
fonctions et les Résultats obtenus pour les deux souches ont été
comparés.
Résultats Avant de déterminer les gènes essentiels, les métriques
des différents échantillons ont été contrôlées et ont permis la validation des deux banques. Après comparatif des Méthodes d’analyse,
c’est le logiciel FiTnEss qui a été utilisé. Nous avons ainsi établi
une liste de 510 gènes essentiels pour PA14oprD en milieux LB
versus 609 gènes essentiels pour PA14 WT. Quatre-vingt-six gènes
étaient spécifiques de PA14 WT et 31 gènes étaient spécifiques à la
PA14oprD. Les 31 gènes spécifiques de PA14oprD ont été annotés
à l’aide des bases de données existantes.
Conclusion L’essentialité de ces 31 gènes, en comparaison avec
PA14WT, est donc la résultante de la perte de la porine OprD. Ils
pourraient donc intervenir dans l’augmentation de la pathogénicité
du mutant vis-à-vis de l’épithélium des voies aériennes. Pour renforcer les Résultats de séquenc¸age, l’essentialité des gènes déterminés
va être vérifiée biologiquement.